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1.引物最好在模板 cDNA 的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)，保守區(qū)是不同物種同一基因的相同序列DNA 序列。

2.引物長度一般在15 ～ 30bp之間。引物長度常用的是18 ～ 27bp，過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不利于PCR反應(yīng)。

3.引物 GC 含量在40%~60％之 間，Tm 值最好接近68 ～ 72 ℃， GC含量過高或過低都不利于反應(yīng)起始。上下游引物的GC含量不能相差太大。Tm值計(jì)算方法可參考公式Tm=4 (G+C)+2 (A+T)  。

4.引物3’端要避開密碼子的第3位。如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3’端最后一個(gè)堿基不能是密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴(kuò)增的特異性與效率。

5.引物3’端一般不建議選擇A。當(dāng)末端堿基為A時(shí)，引發(fā)錯配的概率增加。

6.堿基要隨機(jī)分布。引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在，像CCC或GGG，否則容易導(dǎo)致錯誤引發(fā)。

7.引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。引物自身存在互補(bǔ)序列，容易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，以防止引物二聚體的形成。

引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其△G值不要過高。二聚體的形成會降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。

8.引物5’端和中間△G值應(yīng)該相對較高，而3’端△G值較低?！鱃值可以反映雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性，△G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5’端和中間△G值相對較高，而3’端△G值較低的引物。

9.引物的5’端可以修飾，而3’端不可修飾。擴(kuò)增是由3’端開始的，不能進(jìn)行修飾，而引物的5’端不影響PCR擴(kuò)增的特異性,所以可以進(jìn)行修飾。

10.擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。在選擇引物位置時(shí)，最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。

11.引物應(yīng)具有特異性。引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對其進(jìn)行BLAST比對，不應(yīng)與其它基因互補(bǔ)。